分析方法 | 脂质体药物生物样品分析的挑战

  脂质体药物指将一种或多种活性成分(API)包载于脂质体的脂质双分子层内或(和)内水相内而形成载药脂质体的一类药物制剂。
  作为药物递送载体，其具备生物相容性良好、在体内可被生物降解以及定位靶向性强等优点，在一定程度上改善某些药物在人体内的药代动力学行为及药效，减轻不良反应。
  目前中国已经上市的脂质体药物有注射用盐酸多柔比星、紫杉醇、两性霉素B、盐酸伊利替康脂质体注射液等。
  脂质体药物进入人体后，会释放游离型药物，因而体内会同时存在负载型药物和游离型药物。负载型药物是药物的贮库,游离型药物与药效和不良反应有关。
  因此，针对传统剂型进行血浆总浓度分析的药代动力学研究是不够合适的，甚至可能对脂质体药物产生误导。在进行脂质体药物药代动力学研究时，需要分别测定血液中游离型药物和负载型药物的浓度。
  游离型药物：从脂质体中释放出来的药物，在体内主要以游离和血浆蛋白结合两种形态存在
  负载型药物：存在于脂质体中未被释放的药物
  总药物：游离型药物+负载型药物
  脂质体药物在进入体内后，活性药物一般会以游离型与负载型药物的形式存在，进行生物样本分析时需要对二者进行有效分离。分离生物样本中游离型/负载型药物的常用方法包括平衡透析、超速离心、超滤、固相萃取、排阻色谱等。选取的分离方法应防止脂质体制剂在分离的过程中发生泄漏或破裂。
  对于体内游离型或负载型药物的测定主要包括直接法与间接法。
  直接法：分别测定游离型药物和负载型药物，更能准确体现暴露量。
  间接法：测定总药物浓度和游离型药物浓度，取二者差值即为负载型药物浓度。
  与普通药物相比在生物样本检测方法建立过程中，游离型和负载型药物的分离以及如何保证含有脂质体的生物样本在储存、前处理过程中的稳定是方法开发过程中所面临的挑战。由此而涉及到的校正标样及质控样本的制备、基质效应、选择性、回收率、稳定性甚至离心转速等方面的考察，都与普通药物有着不同的考量。
  1-游离型和负载型药物分离方式选择
  选用合适的分离方法是负载药物和游离药物准确测定的先决条件。样品分离方法应满足：
  ·快速、简单，可用于高通量分析
  ·可有效分离各组分，以保证定量的准确性
  ·避免或减少脂质体在样品制备和储存过程中泄漏出药物
  ·去除血浆中内源性基质的干扰
  超滤法
  原理：游离药物通过超滤膜，而大分子的脂质体药物被保留在上腔室中。分离效果取决于选择滤膜滤孔的大小。
  适用范围：蛋白结合率低的亲水性化合物。
  优势：超滤过程简单明了、操作准确度高。可以收集血浆后立即在现场直接进行，从而消除脂质体在血浆样品中长期保存和冻融带来稳定性问题的影响。
  弊端：药物可能被吸附到超滤装置上，造成准确度的降低。
  原理：填料与化合物的相互作用将游离药物保留在填料中，从而区分游离药物和负载药物。
  适用范围：待测物能够被固相填料吸附，且脂质体双分子层表面组分不与固相填料发生作用，能够顺利通过填料颗粒间的空隙流出。
  优势：可同时分析游离药物和负载药物。
  弊端：该操作复杂、成本较高，需解决脂质体在血浆样品长期保存和冻融带来稳定性问题的影响。
  脂质体的稳定性与多种因素相关，如pH、温度、共存化合物、渗透压、冻融次数等。在游离型药物检测时，脂质体在储存及样品处理过程中的稳定性十分关键。
  如在上述过程无法保持脂质体的稳定性，在采集样本后，应及时对其进行处理，如加入防冻剂、控制温度、PH值、缓冲液浓度等或将脂质体释放的游离型和负载型药物进行分离后再分别进行贮存，以避免在冷冻贮存过程中脂质体发生破裂，干扰后续脂质体药物不同组分的测定。
  3-离心转速
  全血在离心制备血浆样本过程中可能存在脂质体在血浆中分布不均的现象。因此需要考察离心力对脂质体分层和渗漏的影响。可通过对不同离心力下血浆中脂质体和游离药物的峰面积的差异测定来判定脂质体的均一性是否受到影响，从而选择合适的离心力进行血浆样本的制备。另外，脂质体可能在涡旋混合的过程中发生渗漏，因此在制剂的配制过程中需要轻缓，尽可能低转速混合样本或者加入防振摇保护剂。
  4-负载型药物分析
  为了检测负载型药物中被脂质体包裹的药物，需要使脂质体破裂以释放药物。脂质体破封可以通过添加有机溶剂、去污剂、pH调节剂或提高温度等来进行。
  5-质控样品的设计
  因为脂质体样品的不同成份可能会相互影响，为了使生物分析方法准确进行定量，应在适当的基质中制备校准标准样品，质控样品应模拟所产生样品的组成。可以通过将脂质体和游离药物分别加到血浆中来配制负载型药物和游离型药物的校准曲线，质控样品应同时包含负载型药物和游离型药物，以便充分评估这两种成分之间的相互影响。
  硬件设施俱全
  晶易医药生物分析服务平台专有实验场地面积超1300㎡，配备多套LC-MS/MS、GC-MS/MS、ICP-MS、LOGAN全自动透皮扩散系统、高速离心机等。

  质量体系完善
  实验室按照CNAS-CL01等认可文件建立了完善的管理体系，全流程“无纸化”办公，数据监管可溯源。
  项目经验丰富
  ”722”之后，完成生物样本检测项目数量400+项，有使用SPE法和超滤法两种前处理方式，完成盐酸伊立替康、多柔比星、奥沙利铂等多个脂质体临床前体内药代动力学研究的项目经验。项目团队具备丰富的脂质体药物研究经验，也希望能为更多的脂质体药物研究赋能，服务于更多的制药公司和研发机构，缩短研发周期、加快药物上市、造福更多的病患。
  脂质体制剂组分复杂，在生物分析方法建立过程中存在不小的挑战。但始终离不开一个原则，即找到合适的分离方法区分游离型和负载型药物，并避免在整个分析测样周期过程中脂质体药物泄漏或释放，从而影响测定结果。